С начала 20-х годов XVI века в городе начались распространяться идеи протестантской Реформации. Во время Крестьянской войны в Германии (1524—1525 гг.) Ротенбург был одним из центров крестьянских восстаний. В самом городе тогда начали вводить Реформацию. Одновременно иконоборцы во главе с доктором Карлштадтом стали призывать к уничтожению дорогостоящего убранства церквей. Ротенбург в апреле 1525 года вступил в союз с действовавшим в округе крестьянским войском рыцаря Флориана Гейера («Чёрным отрядом»). После того, как он был разбит войсками Швабского союза, по решению городского совета Гейер был выдворен из Ротенбурга. Маркграф Казимир Ансбахский жестоко расправился с городскими мятежниками, наложил на Ротенбург контрибуцию и восстановил католическое богослужение.

В 1543/1544 году при бургомистре Иоганне Хорнбурге в Ротенбурге была окончательно введена протестантская Реформация. Церковными делами в городе руководила Консистория из 3 членов муниципалитета и 3 священнослужителей. Католическими организациями в городе остались лишь Орден иоаннитов (до 1809 года) и Тевтонский орден (до 1672 года), но оба рыцарских ордена вынуждены были отказаться от своих церквей, Святого Иоанна и Святого Якова. Город тогда присоединился к Шмалькаденскому союзу протестантских князей и городов против католического императора Карла V, а во время «Второй маркграфской войны» (1552—1554 гг. поддержал восставшего против императора маркграфа Альбрехта II «Алкивиада» фон Бранденбург-Кульмбаха. После его поражения и бегства Ротенбург сдался, был занят войсками Карла V и был вынужден выплатить контрибуцию в 80 тысяч гульденов.

Рыночная площадь в Ротенбурге со зданием Новой ратуши (1572 – 1578)18

В последующие десятилетиях и до начала «Тридцатилетней войны» 1618—1648 гг. город процветал. Совет и горожане тогда построили много выдающихся зданий в стиле эпохи Возрождения.

В 1609 году Ротенбург присоединился к Протестантской унии – союзу протестантских князей и городов. 12 сентября 1619 года в ситуации уже начавшейся войны в Ротенбурге состоялся съезд участников унии, на котором обсуждался вопрос, должен ли её лидер Фридрих V Пфальцкий принимать богемскую корону.

В «шведский» период «Тридцатилетней войны» в 1631—1634 гг. город неоднократно занимали шведские протестантские войска и императорские католические, но если шведов он пускал добровольно, предоставляя им зимние квартиры, то императорские войска брали его с боем. В последний раз Ротенбург был занят французами в 1645 году и освобождён только в 1650 году уже после Вестфальского мира 1648 года. При подписании мира Ротенбург вынужден был заплатить 50 тысяч гульденов контрибуции, которые ему пришлось взять в долг. Долги вынудили впоследствии Ротенбург к закладам и продажам ценностей и недвижимости. В целом, в результате военных действий, постоев, грабежей и эпидемий его население сократилось наполовину. В дальнейшем развитие города практически остановилось и он потерял какое-либо значение.

В 1688 году во время «Пфальцской войны за наследство» вторжение французских войск снова нанесло тяжёлый ущерб ротенбургской области, но город остался свободным. Тем не менее, его восстановление после всех этих войн растянулось до XVIII века.

В 1802/1803 гг. на основе решений европейских великих держав и немецкого Рейхстага в возмещении князей, которые должны были уступить расположенные на левом берегу Рейна области Франции, имперский город Ротенбург потерял свою независимость и перешёл к Баварии. Для уплаты долгов города Бавария продала тогда много общественных зданий и земельных участков Ротенбурга.