По причине изменения статуса и продолжавшихся внутренних беспорядков король Максимилиан I в 1500 году навязал Регенсбургу новую конституцию, т. н. «Порядок правления» («Regimentsordnung»), которая с некоторыми изменениями 1514 года продолжала действовать до 1803 года.
С 20-х годов XVI века в Регенсбурге, как и во многих других городах империи того времени, стало набирать силу протестантское движение. На Рейхстаге 1541 года в Регенсбурге состоялся религиозный диспут между протестантами, которых представлял сподвижник Мартина Лютера Филипп Меланхтон и католическими богословами. Имевший целью достижение компромисса, диспут закончился провалом, после чего в 1542 году Регенсбург принял протестантизм. Католики тогда были изгнаны из городского муниципалитета, так что городское управление оставалось в руках протестантов до 1803 года. Одновременно немногочисленное католическое население города было лишено прав граждан. В то же время он оставался центром регенсбургской епархии католической церкви во главе с епископом, имевшим статус имперского князя. Помимо него в Регенсбурге было три имперских аббатств: Св. Эммерама, Нидермюнстер и Обермюнстер. Вместе с городским муниципалитетом все они впятером представляли Регенсбург на рейхстагах в качестве независимых субъектов империи.
Политическую значимость Регенсбурга подчёркивает тот факт, что в XVI веке в нём неоднократно проводились общеимперские рейхстаги (в 1532, 1541, 1546, 1557, 1567, 1576). С 1594 и до упразднения Священной Римской империи в 1806 году германские рейхстаги проводились исключительно в Регенсбурге. С 1663 года при императоре Рудольфе II его проведение там приобрело регулярный характер («Постоянный Рейхстаг»; «Immerwährender Reichstag»). На них с того момента помимо субъектов империи присутствовали посланники со всей Европы. По этой причине в городе возникли их многочисленные дипломатические представительства.
Регенсбургский кафедральный собор Святого Петра, в осн. 1275 – 1634 год16
В конце XVIII века город сотрясали тяжёлые внутриполитические конфликты, происходившие на фоне надвигавшегося финансового краха города. Тогда представители бюргерства и муниципалитета по обвинению в бесхозяйственности и нарушениях конституции города подали в Верховный императорский суд в Вене («Der Reichshofrat») иск на руководящий орган – «Тайный совет города» («Der Geheim Rat der Stadt»). В результате император приказал пересмотреть конституцию и предоставил Регенсбургу в ущерб кредиторам мораторий на уплату долгов, что предотвратило его финансовый крах.
Но в 1800 году победоносная французская армия Наполеона Бонапарта расквартировалась в Регенсбурге и округе и своими поборами полностью разрушила финансы города. В 1803 году город вошёл в состав сформированного архиепископом Майнца Карлом фон Дальбергом княжества Регенсбург. Он получил это право в качестве компенсации за потерю его владений по Кампо-Формийскому миру 1797 года между Францией и Австрией. В составе княжества имперский город и епископ как имперский князь потеряли свою независимость, протестанты и католики были уравнены в правах, а имперские аббатства были секуляризированы. 1 августа 1806 года на последнем заседании Рейхстага в Регенсбурге представители образованного Наполеоном 12 июля 1806 года «Рейнского союза» объявили о выходе из Священной Римской империи германской нации, а 6 августа император Франц II отрёкся от престола. Существовавшая с 962 года империя перестала существовать.
Во время очередной войны французов с Австрией 20 апреля 1809 года австрийцы осадили и взяли город, но через три дня он был подвергнут французской армией сильному обстрелу, в результате чего из-за крупных пожаров было разрушено много домов и зданий. Эта война довела Регенсбург почти до полного разорения. Под давлением Наполеона 22 мая 1810 года Дальберг уступил город Королевству Бавария. В его составе он потерял всякое политическое значение, став лишь столицей района Регенсбург. Только позднее, возглавив правительственный округ «Оберпфальц», Регенсбург начал постепенно приобретать всё большее значение. Хотя в 1859 году в городе открылось железнодорожное сообщение с Нюрнбергом и Мюнхеном, это мало повлияло на его экономическое развитие, поскольку в Регенсбурге тогда и в последующий период почти не было промышленности. Ещё долгое время его роль была ограничена тем, что он был экономическим и торговым центром своей сельскохозяйственной округи. Важное значение для развития города имело открытие в 1910 году порта, через который осуществлялся импорт нефти из Румынии.