В это время усилилось военное значение и Троице-Сергиева монастыря, который также включается в систему оборонительных сооружений. С 1540 г. началось строительство крепостных стен и башен монастыря, которое продолжалось десять лет. Для этой работы было привлечено все окрестное население, которое по царской грамоте освобождалось от всех других податей и повинностей. Иоанн Васильевич, часто посещавший монастырь для наблюдения за ходом работ, выделил на строительство три тысячи рублей и дал право троицким властям бесплатно и беспошлинно брать строительные материалы в любом месте, где они найдутся [24, с. 26]. После постройки стен по просьбе монастырских властей крестьянам Переяславльского, Дмитровского и Радонежского уездов вменялось в обязанность поддерживать в порядке крепостные сооружения Троицкого монастыря.

По окончании строительных работ мощные каменные стены протяженностью около полутора километров опоясали Троице-Сергиев монастырь со всех сторон и превратили его в сильнейшую крепость, охранявшую северные подступы к Москве. Даже иностранцы с большим уважением отзывались о крепостных сооружениях Троице-Сергиева монастыря: «Сей монастырь велик и башнями, и валом, и каменною стеною обнесен; во всей России самый знатнейший» [43, с. 23]. Оборонительные сооружения и крепостная артиллерия Троице-Сергиева монастыря были самыми совершенными для своего времени. Это было доказано в начале XVII столетия, когда он оказался неприступной крепостью для осаждавших его в течение шестнадцати месяцев польско-литовских войск.

Ливонская война, начатая царем Иоанном Васильевичем, продолжалась почти двадцать лет и окончилась неудачей, так как после успешного разгрома Ливонии русские войска столкнулись с новыми более сильными противниками: с Польшей и Швецией. Пытаясь во что бы то ни стало добиться успеха в войне, царь учредил Опричнину для борьбы с боярами, которых он считал своими врагами и изменниками. После смерти митрополита Макария, способного своим авторитетом сдерживать жестокую натуру Иоанна IV, вся вторая половина его царствования была заполнена казнями и неслыханными до того на Руси жестокостями. Царь, постоянно тревожный и подозрительный, в каждом встречном видел прежде всего своего врага. Слух о жестоком правлении Иоанна Васильевича распространился по многим странам. Иностранец Одерборн писал: «По всей Европе ходит молва о его страшных жестокостях, и, кажется, в целом свете не найдется человека, который бы не желал тирану всяких адских мук». Другой, более спокойный писатель, Герберштейн, приходит в недоумение, не зная, чем можно объяснить такое ожесточение московского царя [50, с. 76].

Царь Иоанн IV не внимал ходатайствам и просьбам за невинно страдавших. Обличение жестокостей царя и его опричников и ходатайство за осужденных стало причиной опалы святителя Филиппа, митрополита Московского, который по воле Грозного был низложен и умерщвлен. После святителя Филиппа на митрополичий престол был возведен Кирилл, бывший до этого архимандритом Троице-Сергиева монастыря.

Успенский собор Троице-Сергиевой Лавры и надкладезная часовня

Троицкая братия враждебно отнеслась к Опричнине. Почувствовав это, Иоанн IV стал проявлять заметную холодность к нуждам монастыря, что отразилось на темпах строительства Успенского собора, которое велось в основном за счет средств, отпускаемых из царской казны. Строительство соборного храма продолжалось двадцать шесть лет и было завершено лишь по смерти Грозного [23, с. 6]. Среди братии Троице-Сергиева монастыря находилось несколько опальных бояр, которых по приказу Иоанна IV лишили имущества и постригли в монашество. Таким образом в 1565 г. в числе троицких иноков оказался родоначальник княжеского рода Куракиных, боярин Иван Андреевич [105, с. 89]. В число опальных людей попал также троицкий старец келарь Дорофей Курцев, который был в 1570 г. предан по приказу Грозного на растерзание медведю в Александровской слободе [31, с. 109].