Генная инженерия как принципиально новая технология возникла в значительной мере на базе достижений, которых ученые добились при изучении молекулярных процессов, которые происходят в бактериальной клетке. Было сделано несколько важных открытий, прежде чем исследователи научились легко и направленно манипулировать с ДНК, а не просто смешивать фрагменты ДНК с бактериями и отбирать среди них случайно возникающие варианты (реком–бинанты).

Бактерии имеют высокоэффективный механизм защиты от чужеродной ДНК. Исследование этой проблемы привело к обнаружению в бактериях специальных ферментов, получившие название рестриктаз. Первые из них получены еще в 1970 г. Сейчас уже выделено несколько сот разнообразных рестриктаз из клеток разных видов бактерий. Каждый из таких ферментов «узнает» строго определенные короткие (обычно 4—6 п. н.) нуклеотидные последовательности ДНК, которые чаще всего представляют собой палиндромы, и разрезает ДНК на фрагменты по этим участкам. В результате этих свойств рестриктазы стали незаменимым инструментом в исследовании генома, своеобразным скальпелем для ДНК.

Большой удачей для экспериментаторов было то, что в большинстве случаев при нарезании рестриктазами ДНК образующиеся фрагменты содержат «липкие» концы, т. е. способны в дальнейшем соединяться друг с другом. Для восстановления химической связи таких слипшихся фрагментов стали использовать еще один новый класс ферментов – лигазы. Так появились первые инструменты, позволяющие целенаправленно манипулировать с молекулами ДНК in vitro. Следующий важный этап – размножение сконструированных рекомбинантных ДНК, чтобы можно было с ними работать дальше. Для этой цели стали использовать специальные ДНК – векторы, которые представляют собой или бактериофаги, или внехромосом–ные кольцевые молекулы – плазмиды, которые обладают способностью размножаться в бактериальных клетках. Если любой фрагмент ДНК внести в состав ДНК бактериофагов или плазмид, то при переносе в бактериальные клетки он будет там размножаться вместе с вектором. Наконец, были разработаны специальные подходы для отбора бактериальных клеток, в которых содержатся необходимые ре–комбинантные ДНК. Все эти достижения позволили проводить клонирование ДНК, т. е. выделять из сложной смеси молекул определенные участки ДНК и размножать их.

Клонирование фрагментов ДНК дало в руки исследователей принципиально новый подход к выделению из сложной смеси ДНКовых фрагментов конкретных индивидуальных последовательностей. При этом они могли содержать осмысленные тексты (гены) или не содержать таковых. Традиционная биохимия не могла обеспечить подобную процедуру в силу того, что различные фрагменты ДНК химически очень сходны. Но генной инженерии это оказалось вполне под силу. Схематически процесс клонирования ДНК изображен на рис. 13.

После разрезания ДНК на фрагменты с помощью рестриктазы все они соединяются ковалентно с вектором (вектор разрезан той же рестриктазой) в результате «слипания» концов молекул и последующей обработки «гибридов» лигазой. Так в пробирке создается искусственная или рекомбинантная ДНК. Затем осуществляют перенос множества образовавшихся рекомбинантных молекул в бактериальные клетки – трансформацию. Особенность процесса трансформации заключается в том, что в одну бактериальную клетку попадает лишь одна рекомбинантная молекула ДНК. После этого, благодаря отбору, размножаются только бактерии с рекомбинантными ДНК, содержащими требуемые нуклеотидные последовательности.

Для изучения структуры генома необходимо не только клонировать все его участки в виде рекомбинантных молекул, но, главное, расшифровать в них последовательность нуклеотидов, т. е. «прочесть» ДНКовый текст.