Когда в 1596 году польское правительство провозгласило унию, Почаевская лавра решительно выступила против распространения иезуитской системы и ополячивания православных, стойко выдерживая натиск чуждых вероучений и став могущественным духовным центром православия. Обретенные в 1659 году мощи преподобного Иова, бывшего игумена обители, стали последней из трех главных почаевских святынь (кроме следа Стопы Божией Матери и подаренной А. Гойской иконы), прославленных чудесами исцелений. Когда в 1675 году окруженную деревянной оградой обитель решили штурмовать шедшие на Польшу турки, беженцы-миряне и братия могли противопоставить оружию нападавших только веру и молитву – акафист к чудотворной Почаевской иконе. При пении «Взбранной Воеводе» над монастырем явилась Сама Пречистая с распростертым омофором в руках, небесными ангелами и преподобным Иовом, молящимся о спасении обители. Увидев небесное воинство, турки стали пускать в него стрелы, но те возвращались и поражали стрелков. Объятые ужасом иноземцы бежали. Некоторые из них были пленены православными. Несколько пленников приняли христианство и остались до конца дней своих на послушании в Почаеве.

Несмотря на свою стойкость в борьбе, Почаевская лавра с 1713 по 1831 годы находилась под властью униатов.

Как-то в 1759 году лошади ехавшего мимо Почаева графа-католика Николая Потоцкого перевернули коляску. В ярости граф выхватил пистолет, чтобы убить не справившегося с управлением кучера. Поняв, что настал последний миг, тот повернулся в сторону видневшейся обители с молитвой к Божией Матери. Пистолет трижды дал осечку. Ошарашенный Потоцкий заметил в глазах кучера огонек какой-то безумной надежды и, выяснив, в чем дело, немедля отправился в монастырь. Увидев образ, который молитвенно вспоминал кучер, граф принес покаяние и все свои материальные средства направил на благоустройство обители и прославление Почаевской иконы (добился признания ее в 1773 году католической церковью чудотворной с возложением на изображение Божией Матери корон).

Соборный храм Успения Божией Матери – главное украшение Почаевской лавры – построен этим благотворителем обители, графом Николаем Потоцким в 1780 году. Впоследствии в нем были воздвигнуты два придела: один в 1842 году во имя святого Николая Чудотворца и другой в 1859 году в честь святого Александра Невского. В соборном храме над царскими вратами в звездчатом киоте помещалась известная чудотворная Почаевская икона Богоматери. В пещерном храме Святой Троицы в серебряной раке, устроенной в 1842 году графиней Анной Алексеевной Орловой-Чесменской, почивали мощи преподобного Иова Почаевского. Святыней лавры была Стопа Богоматери (отпечаток ноги на плотном известковом туфе). Чудотворный источник, огражденный железной решеткой и покрытый ковчегом, находится внутри церкви Успения Пресвятой Богородицы. Внутри скалы, под стопой, находится пещера, в которой вода стекает по каплям в сосуды и раздается богомольцам. Наверху ковчега находится изображение Стопы.

В 1831 году монастырь вернулся в лоно православия. В 1834 году обитель «по многочисленности стекающихся в оную богомольцев, по великолепию ее церквей, обширности и огромности зданий» четвертой по счету среди русских монастырей получила титул лавры. Название это утвердилось еще при униатах и, вероятнее всего, издавна бытовало среди людей, считавших Почаевскую обитель лаврой по важности ее святынь. Во второй половине XIX в. лавра стала крупным религиозно-просветительным центром. Важное значение в этом отношении имели издания здешней типографии.