После получения в 1875 г. звания кандидата естественных наук Павлов поступил на третий курс Медико-хирургической академии в Санкт-Петербурге (реорганизованной впоследствии в Военно-медицинскую), где надеялся стать ассистентом Циона, который незадолго до этого был назначен профессором кафедры физиологии. Однако Цион уехал из России, после того, как правительственные чиновники, узнав о его еврейском происхождении, воспрепятствовали этому назначению. Отказавшись работать с преемником Циона, Павлов стал ассистентом в Ветеринарном институте, где в течение двух лет продолжал изучение пищеварения и кровообращения. Летом 1877 г. он работал в г. Бреслау, в Германии (ныне – Вроцлав, Польша), с Рудольфом Гейденгайном, специалистом в области пищеварения. В следующем году по приглашению Боткина Павлов начал работать в физиологической лаборатории при его клинике в Бреслау, еще не имея медицинской степени, которую он получил в 1879 г. В лаборатории Боткина Павлов фактически руководил всеми фармакологическими и физиологическими исследованиями.

После длительной борьбы с администрацией Военно-медицинской академии (отношения с которой стали натянутыми после его реакции на увольнение Циона) Павлов в 1883 г. защитил диссертацию на соискание степени доктора медицины, посвященную описанию нервов, контролирующих функции сердца. Он был назначен приват-доцентом в академию, но вынужден был отказаться от этого назначения в связи с дополнительной работой в Лейпциге с Гейденгайном и Карлом Людвигом, двумя выдающимися физиологами того времени. Через два года Павлов вернулся в Россию.

Многие исследования Павлова в 1880-х годах касались системы кровообращения, в частности регуляции функций сердца и кровяного давления. Наибольшего расцвета творчество Павлова достигло к 1879 г., когда он начал исследования по физиологии пищеварения, которые продолжались более 20 лет. К 1890 г. труды Павлова получили признание со стороны ученых всего мира. С 1891 г. он заведовал физиологическим отделом Института экспериментальной медицины, организованного при его деятельном участии. Одновременно он оставался руководителем физиологических исследований в Военно-медицинской академии, в которой проработал с 1895 по 1925 г. Будучи от рождения левшой, как и его отец, Павлов постоянно тренировал правую руку и в результате настолько хорошо владел обеими руками, что, по воспоминаниям коллег, «ассистировать ему во время операций было очень трудной задачей: никогда не было известно, какой рукой он будет действовать в следующий момент. Он накладывал швы правой и левой рукой с такой скоростью, что два человека с трудом успевали подавать ему иглы с шовным материалом».

В своих исследованиях Павлов использовал методы механистической и холистической школ биологии и философии, которые считались несовместимыми. Как представитель механицизма, Павлов считал, что комплексная система, такая, как системы кровообращения или пищеварения, может быть понята путем поочередного исследования каждой из частей; как представитель «философии целостности», он чувствовал, что эти части следует изучать у интактного, живого и здорового животного. По этой причине Павлов выступал против традиционных методов вивисекции, при которых живые лабораторные животные оперировались без наркоза для наблюдения за работой их отдельных органов.

Считая, что умирающее на операционном столе и испытывающее боль животное не может реагировать адекватно здоровому, Павлов воздействовал на него хирургическим путем таким образом, чтобы наблюдать за деятельностью его внутренних органов, не нарушая их функций и состояния животного. В некоторых случаях он создавал условия, при которых пищеварительные железы выделяли свои секреты в фистулы, расположенные вне животного; в других случаях он отделял от желудка часть в виде изолированного желудочка, полностью сохраняющего связь с центральной нервной системой. Мастерство Павлова в этой трудной хирургии было непревзойденным. Более того, он настойчиво требовал того же уровня ухода, анестезии и чистоты, что и при операциях на людях. «После приведения организма животного в соответствие с нашей задачей, – говорил он, – мы должны найти для него