Этот удивительный процесс был потрясающе снят на видео исследователями Токийского университета Хироси Нисимасу и Осаму Нуреки в 2017 г. Используя метод, называемый высокоскоростной атомно-силовой микроскопией, они смогли увеличить изображение в тот самый момент, когда Cas9 захватывала молекулу ДНК. В фильме Cas9 выглядит как позолоченный камень, когда она останавливается на несколько секунд на нити ДНК, прежде чем разрубить ее пополам[76]. После того как Нисимасу выложил это видео в своем аккаунте Twitter, оно стало вирусным и было показано по японскому телевидению.

Однако сориентировать Cas9, чтобы она искала конкретную уникальную последовательность в геноме человека, – это в миллионы раз сложнее, чем разрезать вирусную ДНК. Когда комплекс Cas9 входит в чужеродное пространство клеточного ядра, она сталкивается с лабиринтом ДНК – двадцатью тремя парами хромосом, шестью миллиардами букв ДНК (сравним со стандартным геномом фага, состоящим всего из нескольких тысяч оснований). Попадая в ядро, каждая молекула Cas9 обыскивает плотно упакованные спирали ДНК, чтобы найти последовательности PAM, которые встречаются в среднем один раз за каждый полный оборот двойной спирали на 360 градусов, то есть на 10 нуклеотидов. В целом фермент должен «опросить» 300–400 млн оснований, чтобы определить точную мишень для направляющей РНК, которая сама состоит почти из 20 нуклеотидов.

Йохан Эльф, биофизик из Уппсальского университета в Швеции, подсчитал, что Cas9 обычно требуется около шести часов для обнаружения каждой последовательности PAM в бактериальном геноме с остановками на двадцать миллисекунд на каждом предполагаемом участке, чтобы заглянуть в двойную спираль и проверить, действительно ли он нашел правильную мишень[77]. Но упаковка ДНК в ядре эукариотической клетки намного сложнее, чем у бактерий. Во время лекций, проводимых для студентов в Эдинбургском университете, Эндрю Вуд показывает схему строения бактериальной клетки рядом с извилистым петляющим волокном ДНК млекопитающих. «Cas9 не создана для того, чтобы работать в той среде, в которую мы сейчас ее поместили, – говорит он. – Поразительно, что она способна рассмотреть сотни миллионов нуклеотидов за считаные часы»[78].

После того как Cas9 разрезал ДНК, репаративные ферменты ДНК клетки «зашивают» разрыв. Эксперты удивляются тому, как успешно это работает[79]. Cas9 превосходит даже ранее разработанные технологии редактирования генов ZFN и TALEN[80]. «Они были созданы, чтобы работать с эукариотической ДНК, но тем не менее, по всей видимости, Cas9 превосходит их», – говорит Вуд.

Давайте сделаем паузу и отметим решающую роль, которую играет в этом процессе последовательность PAM: поиск коротких фрагментов PAM вместо распаковки и проверки практически всего генома значительно упрощает задачу для Cas9 по фиксации целевой последовательности. Наличие PAM также объясняет то, что Cas9 не разрезает случайным образом повторы в последовательности CRISPR бактериальной ДНК. Это связано с тем, что, когда последовательности ДНК изначально добавляются к участку CRISPR в геноме бактерий, последовательности PAM отсекаются. Генные инженеры не хотят ограничиваться природным набором последовательностей PAM, поэтому модифицируют исходные ферменты Cas9 и Cas других видов бактерий, чтобы расширить их предпочтения в распознавании короткой последовательности PAM.

Если у бактерий настолько эффективна система безопасности, было бы резонно задаться вопросом: почему вирусы не вымерли? Вирусы незаметно развили множество обходных механизмов – группу белков, которые способны нейтрализовать нуклеазы Cas, известные как белки анти-CRISPR. Вирусы и бактерии подобны хищникам и их жертвам, вовлеченным в бесконечную борьбу, которая продолжается сотни миллионов лет