15 апреля 1395 года произошло великое побоище, в котором принимали участие десятки, если не сотни тысяч воинов. И снова Орда была разгромлена. Понимая, что бежавший в степи Тохтамыш все еще опасен, эмир Тимур решил устроить такой погром, чтобы вообще вывести Улус Джучи из большой политики. Уничтожая все на своем пути, его армия двинулась сначала вдоль Волги от ее устья до города Сарай. Ордынская столица была взята и разрушена. Такая участь ждала и остальные города Улуса Джучи. От Волги Тамерлан смерчем прошелся по европейской части Золотой Орды. Везде, где побывали войска хромого полководца, оставалась только выжженная пустыня. Если кочевому населению еще можно было спастись бегством, то у оседлых жителей шансов уцелеть не было. Именно с этого момента степи к югу от русских границ, включая и Донбасс, были полностью разорены и обескровлены, превратившись в безлюдное Дикое поле.
Золотая орда просуществовала еще почти столетие и, в конце концов, распалась на несколько государств. При этом южная часть Донбасса стала северо-восточной окраиной Крымского ханства и выполняла роль безлюдной буферной зоны между Крымом и Московской державой.
Основным источником доходов Крымских татар были набеги на соседей с целью угона рабов, которые затем продавались в Стамбул. Естественно, жить рядом с такими соседями желающих было мало, так что Донбасс оставался слабозаселенным. Однако постепенно с севера в регион переселялись наиболее решительные славяне, которые заселяли речные долины, где вели жизнь вольных охотников и рыбаков. Со временем эти свободные люди получили название казаков.
Кроме того русское царство чтобы защищаться от набегов кочевников было вынуждено создать глубокоэшелонированную систему обороны на своих южных рубежах. Её основу составляли засечные черты, представлявшие собой многокилометровые непрерывные заграждения из засек (поваленных крест-накрест вершинами в сторону противника деревьев), частоколов, рвов и земляных валов, усиленных крепостями с гарнизонами.
Такие засечные черты располагались гораздо севернее Донбасса, но базировавшиеся там русские сторожевые отряды, выходили далеко в степь для наблюдения за татарами. Со временем южнее старых оборонительных линий строились новые крепости, которые становились основой для новой засечной черты, под защитой которой строились новые деревни и города. Так Русь продвигалась на юг, осваивая новые земли. В XVI – XVIII веках приграничные земли в районе Белгородской засечной черты были заселены выходцами из центральных русских областей и православными переселенцами из Малороссии, принадлежавшей тогда Речи Посполитой. Новые жители освобождались от уплаты налогов, а за это должны были нести сторожевую службу и оборонять пограничье от татарских набегов. Эта земля получила название Слободской Украины и стала плацдармом для продвижения вглубь степи и освоения Донбасса. Сегодня земли Слобожанщины составляют Харьковскую и Сумскую области Украины и Белгородскую область Российской Федерации.
Скорее всего, в это время в меловых горах над Северским Донцом возник пещерный монастырь, известный сегодня как Святогорская свято-успенская лавра. Впрочем, точная дата его возникновения никому не известна, что дает возможность некоторым авторам утверждать, что он возник еще во времена Киевской Руси. Как бы то ни было, первые письменные упоминания о святых горах относятся к 1526 году, а в 1624 году монахам обители была пожалована царская грамота на право владения землёй.
В 1571 году на реке Бахмут была основана укрепленная слободка, впоследствии выросшая в город Бахмут, современный Артемовск. В середине семнадцатого века в Донбассе были построены русские крепости Тор (современный город Славянск) и Маяцкий городок (современное село Маяки). Как минимум с 1625 года к соленым озерам, расположенным в районе нынешнего Славянска стали регулярно отправляться группы россиян, которые тут из озерной воды вываривали соль, которую использовали как для своих нужд, так и для продажи. Уже к середине семнадцатого века тут были настоящие соляные заводы, для защиты которых от татарских набегов в Торе размещается русский гарнизон.