Первое захоронение в усыпальнице датируется 1498 годом, когда здесь был погребен Василий Юрьевич Захарьин-Кошкин – московский боярин, служивший с 1493 года Ивану III. Могила его неизвестна. Последнее состоялось в 1679 году, когда в усыпальнице была погребена дочь царя Михаила Федоровича. Ирина Михайловна была похоронена уже под новым собором, строительство которого было закончено в 1647 году. Старый храм был разобран «до подошвы», и одной из главных причин, побудивших царя Михаила построить новый храм, как считал И.Д. Дмитриев (1909), было желание, «чтобы тела царских пресветлых родителей покоились не вне храма, как многие из них, вследствие увеличения размера усыпальницы, могли бы остаться, но непременно под сводами его».

Первое документальное упоминание об усыпальнице Романовых относится к 1616 году. Именно в этом году по указу матери царя инокини Марфы из Государевой Царицыной палаты были доставлены новые покровы на все гробницы. Таких покровов было изготовлено 46, возможно, по числу надгробий. Известно «Описание царских пресветлых прародителей… благородные их телеса положены… во обители Всемилостивого Спаса на Новом», составленное 12 июня 1687 года, так называемый Новоспасский Помянник. В нем значатся 70 имен. Помянник составлялся, по-видимому, как по монастырским Кормовой и Вкладной книгам и разновременным синодикам, так и по фактически существовавшим надгробиям. В XVII веке усыпальница соблюдалась в «наибольшем порядке», так как имела в это время прямое попечение первых Романовых: описаны частые царские выходы для молитв на могилах предков.

К сожалению, замечательный монастырь вплоть до второй половины XVII века не имел исторического описания. Первое из них было составлено по распоряжению императрицы Елизаветы Петровны от 10 июля 1759 года при настоятеле архимандрите Иакинфе (Карпинском). Опубликовано оно было лишь в начале следующего века – в 1802 году архимандритом Ювеналием (Воейковым). В нем содержатся подробные сведения о подклете собора, гробницах предков Романовых и приводятся надписи на них.

В XVIII столетии, когда столица России была перенесена в Санкт-Петербург и изменилась политика по отношению к монастырскому землевладению, вклады в обитель со стороны царствующих особ почти прекратились. К этому прибавилось несколько сильных пожаров. К началу следующего века усыпальница оказалась в полуразрушенном состоянии. На протяжении XVIII и XIX столетий здесь участились захоронения различных светских лиц, которым удалось доказать свое родство с Романовыми. Возможно, здесь сыграло свою роль и бедственное материальное положение монастыря. Так в усыпальнице появились могилы представителей известных княжеских и дворянских родов Дашковых, Голицыных, Новосильцовых, Куракиных, Еропкиных и др., потеснившие могилы предков Романовых.

Усыпальница, как и весь монастырь, на протяжении веков неоднократно осквернялась иноземцами, совершавшими грабительские набеги на Москву, – татарами, поляками. Трагедией для всего монастыря стало французское нашествие. Долгое время монастырь не имел возможности приступить к ремонту усыпальницы. Есть упоминание о частичном настиле полов «из белой лещеди» в 1837 году при архимандрите Аполлосе. При нем же было составлено дошедшее до наших дней описание надгробных памятников.

Крупный ремонт с частичным восстановлением надгробий был проведен в 1857 году по указанию Императора Александра II. Подлинного дела об этом ремонте не сохранилось, но по некоторым упоминаниям можно сделать вывод, что на многих могилах были установлены надгробия, выбиты новые надписи, причем во многих случаях это было сделано предположительно согласно расплывчатым и ошибочным указаниям поздних маргиналий Кормовой книги. К 300-летию Дома Романовых (1913), когда усыпальницу снова посетил Император с Августейшим семейством, она в очередной раз была приведена в порядок. Во время пребывания Государя в монастыре ему была подарена точная модель Преображенского собора с усыпальницей царских прародителей с указанием всех существующих гробниц, искусно выполненная звонарем Новоспасского монастыря Михаилом Долинским.