Стоглав совмещает признаки канона поместных соборов и канона святых отцов. Он написан в виде ответов высших иерархов церкви на царские вопросы о церковном «строении». Порядок следования глав неясен. Вопросы разбиты на две группы. Ответы на первые 37 вопросов охватывают основную часть Стоглава. Другие 32 ответа помещены «чересполосно» с вопросами в одной (41‑й) главе памятника.

Для верного понимания информации Стоглава необходимо знать, кто был составителем вопросов, содержащих своеобразную программу реформ, представленную правительством на рассмотрение церковного собора. Приписывались они Ивану IV, но составлены были не им, а лишь по его распоряжению – несколькими лицами (священником Сильвестром, митрополитом Макарием, Максимом Греком, старцем Артемием) либо одним Сильвестром, принимавшим участие в подготовке обращения Ивана IV к собору (25‑й, 26‑й, 27‑й и 29‑й вопросы прямо заимствованы из его послания царю).

Вопросы, представленные Собору, свидетельствуют о сакрализации и расширении функций светской власти. Именно царь выступил инициатором созыва Собора, призванного «оздоровить» русскую церковь. При этом он именует себя и своего отца – наряду с духовенством – «пастырями». Иван IV подверг сомнению необходимость сохранения монастырского землевладения и неподсудности церковных людей царскому суду. Центральное место занимает тема злоупотреблений белого духовенства и монашества. Сначала царь критиковал церковное судопроизводство (получение «святителями» посулов, волокиту). Серьезную опасность для чистоты православия, по мнению царя, представляли ошибки в переводах богослужебных книг. Резкой критике подвергался весь строй монашеской жизни. Подчеркивалось, что даже сами монастырские власти зачастую содействовали разорению монастырей и их земельных владений. Ряд вопросов касался нравственного облика прихожан и их поведения.

Второй комплекс царских вопросов (в количестве 32) был посвящен сюжетам, связанным с церковной практикой. Здесь же ставилась проблема борьбы с «ересями» и суевериями в среде мирян.

Большинство участников Собора поддержали строгую регламентацию церковно-монастырского быта, что должно было укрепить авторитет церкви. Были приняты постановления, касающиеся укрепления церковного благочиния (о церковных службах, обрядах во внутреннем распорядке в церквах, о порядке церковного пения и колокольного звона), введено требование беспрекословного подчинения священников и дьяконов протопопам, которые вместе с «поповскими старостами» обязаны были следить за исправным отправлением церковных служб и поведением клира. Непослушание протопопам, пьянство, небрежность в церковном богослужении наказывались отлучением от церкви. Подтверждено было запрещение симонии (поставления на церковные должности «по мзде»), а также вдовым попам служить в церкви.

Впервые в Москве и других городах создавались специальные училища для подготовки священников и дьяконов. Священники обязывались поддерживать в сохранности иконы (которые должны были писаться, «смотря на образ древних иконописцев») и сверять церковные книги с «добрыми переводами».

Стоглавом были жестко определены пошлины, взимавшиеся священниками («венечная» – за совершение обряда бракосочетания, за освящение церкви и др.). При этом ликвидировался институт владычных десятинников, которые собирали пошлины с церквей. Отныне «святительскую дань» собирали земские старосты и десяцкие священники. «Венечную» пошлину должны были собирать поповские и десяцкие старосты.

Собор санкционировал строгие наказания за преступления против нравственности (в том числе содомский грех, непослушание родителям, ложная присяга и др.). Под страхом церковных наказаний было запрещено чтение еретических и отреченных книг. Определялись меры помощи неимущим и немощным.