Метод хроматографии Хорошим методом для идентификации антибиотиков и их продуцентов является метод хроматографии, открытый выдающимся русским ученым Цветом еще в 1903 г. и теперь очень широко используемый в лабораторной практике. Метод широко применяется при идентификации антибиотиков на ранних стадиях исследования, что имеет весьма важное значение. Определение антибиотика на ранних стадиях работы может значительно сократить время его изучения. Иногда метод хроматографии бывает необходимо дополнить данными методов электрофореза, которые помогают выяснить прежде всего ионный характер антибиотика.

Метод бумажной хроматографии антибиотиков состоит в следующем. На полоски хроматографической бумаги длиной 20-30 см и шириной в 1 см наносится испытуемый антибиотик. Подсушенные на воздухе полоски хроматографической бумаги с нанесенным антибиотиком помещают затем в хроматографический бак или цилиндр с соответствующим растворителем на 10-20 ч. Время выбирается в зависимости от скорости прохождения растворителя и от высоты используемого сосуда для хроматографии.

Для обнаружения антибиотиков па хроматограммах могут применяться биологические, химические и физические методы.

Наиболее распространенным методом обнаружения антибиотиков на хроматограммах является биоавтографический метод. С этой целью высушенные в вытяжном шкафу полоски бумаги накладываются на агаровую пластинку, предварительно засеянную культурой тест-организма, чувствительной к изучаемому антибиотику. Кюветы с полосками бумаги помещают в термостат на 18-20 ч при температуре, оптимальной для роста тест-организма. По зонам отсутствия роста тест-микроба, образующимся вокруг тех мест на хроматограмме, где находится пятно антибиотика, судят, во-первых, об однородности антибиотика; во-вторых, сравнивают полученные хроматограммы с хроматограммами известных антибиотических веществ (рисунок 1).

а – стандартный раствор пенициллина G; б, в – хроматограмма производственных образцов 1950 г. За пятном пенициллина G (вверху) следуют пенициллин F, дигидро F и самая нижняя зона – пенициллин К; г – хроматограмма конечного препарата калиевой соли (1950).

Рисунок 1 – Использование метода бумажной хроматографии для разделения пенициллинов, образуемых штаммом Q-176 на кукурузной среде с лактозой

Химические методы обнаружения антибиотиков на хроматограммах основаны на реакциях, в результате которых образуются соединения, выявляемые по соответствующей окраске или обесцвечиванию реактива в месте расположения пятна антибиотика.

Физические методы обнаружения антибиотиков включают в себя способы, связанные:

а) с выявлением люминесценции антибиотического пятна в ультрафиолетовом (УФ) возбуждении;

б) с поглощением УФ излучения;

в) с определением радиоактивной метки антибиотика.

Для целей бумажной хроматографии антибиотиков с успехом можно использовать и круговые хроматограммы.

Важное значение при оценке результатов хроматографии имеет положение пятен исследуемых веществ, характеризуемое коэффициентом R_>f. Коэффициент R_>f определяется отношением расстояния, которое проходит пятно изучаемого вещества от линии старта за определенное время, к расстоянию фронта растворителя, прошедшего от линии старта:

где Sp – расстояние, пройденное пятном изучаемого вещества;

Sf – расстояние фронта растворителя, пройденное от старта.

Воспроизводимость значении R_>f зависит от постоянства следующих факторов: качества бумаги, температуры, степени чистоты растворителей, состава газов атмосферы, в которую помещена бумага, однотипности процедур и аппаратуры.