В 1865 году Николай Николаевич защитил докторскую диссертацию «Исследования над явлениями вытеснения одних элементов другими». В этой работе ученый показал влияние начальных концентраций реагентов на направление реакций, зависимость его от давления, влияние которого он понимал как влияние концентрации газов. Таким образом, Бекетов, по сути, предвосхитил открытие закона действия масс. Тогда же Николай Николаевич составил ряд металлов по способности вытеснять друг друга, который впоследствии в точности совпал с рядом напряжений.

Научные работы Николая Бекетова посвящены изучению зависимости направления химических реакций от состояния реагентов и внешних условий, исследованию химического сродства и того, какими свойствами это сродство определяется. Бекетов открыл вытеснение металлов из растворов их солей водородом под давлением; установил возможность протекания реакции в двух направлениях и дал точное определение состояния равновесия; исследовал вытеснение одних элементов другими из их соединений и связал эти процессы с «первоначальными химическими свойствами элементов – тем, что называется химическим сродством». Стремясь связать химические явления с «относительными массами и расстояниями между действующими частицами», Бекетов вплотную подошел к идее, что химические свойства веществ определяются свойствами их атомов – атомной массой и радиусом. (А между тем, сделан этот вывод был еще до опубликования Периодического закона, немудрено, что Николай Николаевич с таким восторгом воспринял теорию Менделеева.) Исходя из своих представлений о «прочности» (в современной терминологии – стабильности) соединения элементов с близкими атомными массами, Бекетов предложил в качестве наиболее сильного восстанавливающего агента алюминий. С его помощью химик осуществил восстановление некоторых металлов из их оксидов при высоких температурах, создав основы метода, позже вошедшего в практику под названием алюминотермии. Этот метод теперь широко используется в металлургии.

Студенты запомнили Бекетова как прекрасного лектора, умеющего увлекать слушателей. Часто по ходу лекции Николай Николаевич отвлекался от основной линии изложения на предметы, казалось бы, второстепенные. Но именно они неожиданно захватывали профессора. Он прямо при студентах и как бы вместе с ними начинал работать над решением проблемы, над которой до того не задумывался, рисовал перспективы, находил связи с другими важными вопросами химической и физической науки. То же происходило и на практике. Многие свои открытия Николай Бекетов сделал совместно со своими студентами и лаборантами. На экзаменах профессор был мягок и снисходителен (его и студенты, и петербургские академики называли «добрейшим Николаем Николаевичем»), но, несмотря на это, уважение к нему было столь велико, что студенты приходили, хорошо подготовившись. Тому причиной, вероятно, и хорошая посещаемость интересных лекций Бекетова в течение учебного года. Среди учеников одного из отцов физико-химии знаменитые ученые Флавицкий, Эльтеков, Хрущев.

«Удивительная простота в обращении, бесконечная доброта и сердечность, прямота и безыскусственность пленяли всякого, кто знал Н. Н. Бекетова», – вспоминал еще один из его воспитанников профессор Танатар в 1912 году.

В 1868 году Бекетов был избран ординарным профессором по кафедре химии Новороссийского университета, но по просьбе коллектива университета Харьковского остался в городе. С 1872 года при университете работало Харьковское физико-химическое общество под руководством Николая Бекетова. Деятельность его на ниве химических исследований была исключительно активна. Вместе с учениками он в организованных им же термохимических лабораториях определил теплоту образования оксидов и хлоридов щелочных металлов, в 1870 году впервые получил безводные оксиды щелочных металлов. (Через девять лет за это он получил Ломоносовскую премию Санкт-Петербургской академии наук.) В 1886 году Бекетовым была фактически высказана идея цепного механизма горения и взрыва. В том же году увидел свет его учебник «Физико-химия».