Доктор Гийотен участвовал в комиссии, на которую была возложена обязанность научно исследовать вопрос о колдовстве, требовалось доказать сельскому населению его абсурдность. В середине XVIII столетия в университетском городе Вюрцбурге на основании экспертного заключения медицинского факультета была сожжена одна девушка, признанная колдуньей. Этот яркий факт показывает, что дикость и невежество отнюдь не прерогатива крестьян. В 1784 году Гийотен был включен в представительную комиссию, которая исследовала целебную силу животного магнетизма Месмера, чудесные исцеления которого вызвали громадную сенсацию в Париже, особенно в придворных кругах.

Тяжелое экономическое положение Франции побудило Людовика XVI созвать в 1789 году Генеральные штаты, не собиравшиеся с 1614 года. Одновременно было предложено ученым и другим образованным людям высказаться по составу этого высшего сословно-представительского учреждения. Гийотен, не занимавшийся до того политикой, изложил 8 декабря 1788 года свои взгляды в брошюре «Pétition des citoyens domiciliés á Paris», которая сразу сделала его героем дня. В ней «с удивительной яркостью и образцовой умеренностью» была представлена точка зрения третьего сословия. Историк Шассэн (Chassin) характеризует брошюру как «весьма замечательный политический и литературный труд, принадлежащий по времени и значению к первым символам веры, подготовившим великое революционное движение». От имени 3-го сословия Гийотен требует допустить к работе в Генеральных штатах столько же представителей третьего сословия, сколько предполагало участвовать представителей от дворянства и духовенства вместе взятых.

Официальные представители парижской буржуазии приняли брошюру Гийотена как свою политическую программу. Парламент наложил на нее запрет, и вскоре Гийотен был вызван для допроса. Он объяснил свои мотивы: «Мной руководили не личные интересы, а лишь патриотизм и забота об общественном благе». Говорят, он проявил в своей речи такую силу убеждения, что огромная толпа, присутствующая на заседании парламента, устроила ему на выходе овации, увенчала цветами и с триумфом проводила домой. Так начиналась его политическая карьера.

Доктор Гийотен был избран в Генеральные штаты представителем парижской буржуазии, в числе десяти депутатов от Парижского округа. 5 мая 1789 года, в первый день заседания в Версале, Гийотен был избран инспектором зала заседаний. Должность была весьма престижной и ответственной на стадии организации работы штатов. В этом же году депутаты 3-го сословия Генеральных штатов объявили себя Национальным собранием.

По предложению Гийотена Национальное собрание учредило в 1790 году комиссию общественного здравоохранения. Будучи членом этой комиссии, он внес в собрание в 1791 году от имени комиссии проект реформы медицинского обслуживания населения и образования во Франции. Преподавание на медицинских факультетах было поставлено неудовлетворительно. Парижский факультет имел 7 кафедр (акушерство, патология, физиология, фармация, латинская и французская хирургия и materia medica), но практические занятия на них были непопулярны; клинического преподавания не было почти никакого, так как факультет находился вне всякой связи с больницами. Первую клинику во Франции по внутренним болезням открыл в Париже Дебуа де Рошфор (Desbois de Rochefort) в 1795 году. В течение целого года в Париже для анатомирования пользовались лишь двумя трупами. Врачи, прошедшие обучение, не имели никакой практической подготовки и, как горько острил Декарт, получали необходимый опыт лишь после массового убийства своих пациентов.