А Карлос, влюбленный в молодую королеву, сгорал от нежных чувств к бывшей невесте и ненависти к лицемерному родителю. Испанский король в самом деле слыл в Европе монархом лживым, хладнокровным и хитрым. Казалось, сын перенял у него самые плохие черты, став еще более жестоким и бесчеловечным. А жизнь преподносила наследнику еще более суровые испытания.

В начале мая 1562 года семнадцатилетний инфант, спускаясь по лестнице своего дворца, неосторожно оступился, покатился по ступеням и сильно ударился об пол. Принца, потерявшего сознание, отнесли в его спальню, а врачи, осмотрев дона Карлоса, посчитали, что жить ему осталось недолго. Однако королевский врач Андрео Басилио пошел на крайние меры и вскрыл череп больного, выпустив оттуда жидкость. Тем самым врач вернул принца к жизни. К сожалению, наследник частично остался парализованным, а мучительные головные боли преследовали его всю жизнь.

Когда Карлос немного поправился, отец решил женить сына на принцессе Анне Австрийской, которая была младше наследника на четыре года и являлась его кузиной. Знакомый с ней с раннего детства, Карлос не стал противиться предстоящему союзу, однако события внезапно приняли совершенно иной оборот.

Инфант, сгораемый от ненависти к собственному отцу, имел неосторожность сообщить одному церковнику о намерении убить собственного родителя. Священник, испугавшись за жизнь своего покровителя, Филиппа II, не замедлил доложить тому о нависшей угрозе.

Испанский монарх, и раньше не питавший особых чувств к сыну, теперь нашел удобный момент для отстранения дона Карлоса от престола и лишения его титула королевского наследника. Столь серьезное решение должны были поддержать и государственные советники, которых монарх созвал к себе, с тем, чтобы решить вместе с ними дальнейшую судьбу сына. Филипп II сообщал, что более не намерен терпеть выходки своего ребенка, в судьбе которого он старался принимать самое активное участие, и просил Совет дать согласие на арест наследника. Однако ждать ответа советников монарх не стал.

Он сразу же заточил принца под стражу, а спустя несколько дней отправил его в тюрьму. Там Карлосу не позволяли никаких излишеств, и даже когда королева Изабелла решила навестить своего пасынка, ей категорически запретили это сделать. Безутешный инфант перестал есть, отказался от одежды и глотал лед, что привело к болезненной лихорадке.

Несколько дней врачи пытались его вылечить, однако никакие лекарства принцу не помогали. Ему становилось хуже, пока, наконец, придворный врач не сообщил монарху, что Карлос, возможно, доживает свои последние дни. Такой поворот событий был весьма выгоден королю, и он велел лекарю не предпринимать никаких действий, чтобы вдруг не вылечить умирающего наследника. А тому с каждым днем становилось все хуже. Когда о начавшейся агонии доложили Филиппу, тот решил в последний раз навестить сына. Однако Карлос уже никого не узнавал. Он умер на рассвете 24 июня 1568 года.

Его похоронили со всеми почестями в одной из мадридских церквей, а спустя несколько месяцев умерла и его бывшая невеста, третья жена короля Филиппа, Изабелла. Считается, что причиной ее смерти была внезапная потеря ребенка, которого королева носила под сердцем несколько месяцев, и последовавшее за этим событием заражение крови.

Наследников у монарха не оставалось, поэтому он решился на четвертый брак. Следующей его женой, по воле судьбы, снова стала невеста сына, Анна Австрийская, с которой Филипп II был обвенчан в 1570 году и которая подарила уже немолодому супругу сына, ставшего впоследствии испанским королем Филиппом III.